本发明公开了合欢皮抗肿瘤有效部位提取物及其制备方法和在制备抗肿瘤药物中的应用。合欢皮抗肿瘤有效部位提取物是通过合欢皮水提醇沉，先后用乙酸乙酯、水饱和的正丁醇萃取，正丁醇提取物硅胶柱分离，其中二氯甲烷-甲醇（1∶1）洗脱部位得到的合欢皮抗肿瘤有效部位提取物，它具有明显的抑制U251（胶质瘤细胞）的作用，可以用于制备抗肿瘤药物。
1.合欢皮抗肿瘤有效部位提取物，其特征是：它是由合欢皮粉碎后，用水于90-100℃加热提取，提取液浓缩，醇沉，离心除去沉淀，减压浓缩除去乙醇，用乙酸乙酯及水饱和正丁醇依次萃取，正丁醇提取部分进行硅胶柱分离，洗脱剂为不同比例的二氯甲烷-甲醇，收集1∶1比例的洗脱液，回收有机溶剂后得到的合欢皮抗肿瘤有效部位提取物，所述的抗肿瘤是抗肿瘤细胞U251。
2.一种制备权利要求1所述的合欢皮抗肿瘤有效部位提取物的方法，其特征是它包括如下步骤：步骤1.将合欢皮粉碎，用水回流提取或煎煮，冷却，离心，浓缩提取液，用95％乙醇进行醇沉，离心除去沉淀，浓缩除去乙醇，得提取液；步骤2.将步骤1的提取液依次分别用乙酸乙酯和水饱和的正丁醇溶液进行萃取，其中正丁醇提取部分进行硅胶柱分离，洗脱剂为不同比例的二氯甲烷-甲醇，收集1∶1比例的洗脱液，旋转蒸发回收有机溶剂后，即得合欢皮抗肿瘤有效部位提取物。
3.根据权利要求1所述的合欢皮抗肿瘤有效部位提取物在制备抗肿瘤细胞U251药物中的应用。
4.根据权利要求3所述的合欢皮抗肿瘤有效部位提取物在制备抗肿瘤细胞U251药物中的应用，其特征是：所述的抗肿瘤细胞U251药物是合欢皮抗肿瘤有效部位提取物与药学上可接受的载体或辅料组成。
5.根据权利要求3所述的合欢皮抗肿瘤有效部位提取物在制备抗肿瘤细胞U251药物中的应用，其特征在于：将其制备成临床上可接受的注射制剂或口服制剂；其中所述的注射制剂存在形式包括脂质体、纳米或胶束；所述的口服制剂包括固体分散体、片剂、颗粒剂、软胶囊、硬胶囊、口服液或缓控释型剂型。技术领域
本发明涉及合欢皮抗肿瘤有效部位提取物、含有它的药物组合物及其制备方法和在制备抗肿瘤药物中的应用。xa0
背景技术
合欢皮为豆科植物合欢(Albiziaxa0julibrissinxa0Durazz.)的干燥树皮，具有解郁安神，活血消肿的功能，用于心神不安、忧郁失眠、肺痈疮肿、跌扑伤痛等症。现代药理实验表明，合欢皮具有抗癌、镇静、抗生育、PAFxa0受体拮抗和抗炎等作用[参见：陈丽敏,xa0康晓星,xa0王华,xa0邱丽颖,xa0冯磊,xa0金坚.xa0海峡药学.xa02010,22(1):36-391]。对合欢皮有效成分的研究表明：合欢皮中含有三萜、黄酮、木脂素、生物碱、鞣质、多糖、甾醇、吡啶衍生物、脂肪酸甘油酯等多种化学成分。近年来的研究发现合欢皮皂苷具有较强的抑制癌细胞活性，可有效抑制多种实体瘤的生长[参见：花慧，冯磊，张小平，张莲芬，金坚.xa0华西药学杂志2011，26(xa03)xa0:229xa0～xa0231；刘玲艳，杜芳芳，冯磊，邱丽颖.xa0时珍国医国药.xa02011,22(3):762-764]，可能成为临床防治肿瘤的一个新的重要治疗策略。中国专利申请CN200810020496.3《合欢皮中具有抑制血管生成作用的活性成分及其制备方法和应用》，涉及了合欢皮具有抑制血管生成作用的活性成分为皂苷类化合物，未涉及正丁醇部分。中国专利申请CNxa0CN200810242777.3《一种用于抑制血管生成的合欢皮提取物的制备方法和应用》、CN201010577812.4《一种用于抑制血管生成的合欢皮提取物的制备方法和应用》、CN201110116041.3《合欢皮抗肿瘤新生血管有效部位提取工艺路线的优化及中试放大》，涉及了合欢皮正丁醇提取的部分，未涉及正丁醇提取部位的进一步分离。
发明内容
本发明的目的之一是，提供合欢皮抗肿瘤有效部位提取物及其制备方法。本发明的目的之二是，提供一种以所说部位为有效成分的药物组合物。本发明的目的之三是，提供所说有效部位在制备抗肿瘤及相关药物中的应用。本发明的技术方案如下：合欢皮抗肿瘤有效部位提取物，它是由合欢皮粉碎后，用水回流或煎煮提取，提取液浓缩，醇沉，离心除去沉淀，减压浓缩除去乙醇，用乙酸乙酯及水饱和正丁醇依次萃取，正丁醇提取部分进行硅胶柱分离，洗脱剂为不同比例的二氯甲烷-甲醇，收集1∶1比例的洗脱液，回收有机溶剂后得到的合欢皮抗肿瘤有效部位提取物。一种制备上述合欢皮抗肿瘤有效部位提取物的方法，它包括如下步骤：步骤1.xa0将合欢皮粉碎，用水回流提取或煎煮，冷却，离心，浓缩提取液，用95%乙醇进行醇沉，离心除去沉淀，浓缩除去乙醇，得提取液。步骤2.xa0将步骤1的提取液依次分别用乙酸乙酯和水饱和的正丁醇溶液进行萃取，其中正丁醇提取部分进行硅胶柱分离，洗脱剂为不同比例的二氯甲烷-甲醇，收集1∶1比例的洗脱液，旋转蒸发回收有机溶剂后，即得合欢皮抗肿瘤有效部位提取物。本发明进一步提供了合欢皮抗肿瘤有效部位提取物在制备抗肿瘤药物中的应用。以抑制U251增殖能力为活性指标进行抗肿瘤活性实验。实验结果表明，在体外细胞毒实验中，可以明显抑制U251的增殖，具有细胞毒作用，可用于制备抗肿瘤治疗药物。本发明还提供了以所述方法制备的有效部位的药物组合物。所述药物组合物是以本发明的有效部位为有效成分，与药学上可接受的载体所组成，并以适合药用的制剂形式存在，这些制剂形式可以是片剂、糖衣片剂、薄膜衣片剂、肠溶衣片剂、缓释片剂、胶囊剂、硬胶囊剂、软胶囊剂、缓释胶囊剂、口服液、合剂、口含剂、颗粒剂、冲剂、丸剂、散剂、膏剂、丹剂、混悬剂、溶液剂、注射剂、粉针剂、冻干粉针剂、栓剂、软膏剂、硬膏剂、霜剂、喷雾剂、滴剂、滴丸剂和贴剂等。有益效果（1）本发明首次发现合欢皮的正丁醇萃取部分的二氯甲烷-甲醇（1∶1）洗脱部位具有抗肿瘤活性，并首次在U251（胶质瘤细胞）上进行药效筛选，活性好，适宜开发成抗肿瘤中药新药。（2）本发明拓展了抗肿瘤药物的原料渠道，扩大了合欢皮的用途，使合欢皮发展成为抗肿瘤药物的新原料，可显著提高合欢皮的附加值。
具体实施方式
以下所列实施例有助于本领域技术人员更好地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。实施例1.xa0合欢皮抗肿瘤有效部位提取物的制备将合欢皮干燥粉碎，取药物粉末80g，加蒸馏水700xa0ml，回流提取2h，分离提取液，再加蒸馏水700ml提取，如此重复3次，合并3次提取液，浓缩至300ml，加95%乙醇800xa0mL搅拌，静置过夜，离心，弃去沉淀，减压回收乙醇，继续浓缩至300ml，加等体积的乙酸乙酯萃取2次，合并乙酸乙酯萃取液，回收乙酸乙酯，得乙酸乙酯部位。剩下的水液减压除去残留的乙酸乙酯后，用等体积水饱和的正丁醇萃取2次，合并水饱和正丁醇萃取液，回收正丁醇，得正丁醇部位。硅胶柱分离正丁醇部位，称取20xa0g硅胶湿法装柱，0.7xa0g正丁醇萃取部位和2g硅胶以甲醇相混合制样。配置不同比例的二氯甲烷和甲醇混合液（50∶1；xa030∶1；xa020∶1；xa010∶1；1∶1）各150ml，收集比例为1∶1的洗脱液，浓缩，真空干燥，得合欢皮抗肿瘤有效部位提取物。实施例2.xa0合欢皮抗肿瘤有效部位提取物的制备将合欢皮干燥粉碎，取药物粉末60g，用10倍质量的蒸馏水回流提取3h，离心后的残渣重复提取1次，离心，合并二次水提取液，浓缩至100ml，加95%乙醇进行醇沉，药液中乙醇的浓度约为60%，静置过夜，离心，弃去沉淀，减压回收乙醇，继续浓缩至100ml，加等体积的乙酸乙酯萃取2次。剩下的水层减压除去残留的乙酸乙酯后，用等体积水饱和的正丁醇萃取3次，合并水饱和正丁醇萃取液，回收正丁醇，得水饱和正丁醇提取物2.5g。正丁醇提取物过硅胶柱，配置不同比例的二氯甲烷和甲醇混合液（50∶1；10∶1；xa01∶1）各300ml，收集比例为1∶1的洗脱液，浓缩，真空干燥，得合欢皮抗肿瘤有效部位提取物。实施例3.xa0合欢皮抗肿瘤有效部位提取物的制备将合欢皮干燥粉碎，，取药物粉末80g，用5倍量的蒸馏水回流提取3h，重复3次，合并提取液，离心，浓缩至200ml，加95%乙醇进行醇沉，药液中乙醇的浓度约为60%，静置过夜，离心，弃去沉淀，减压回收乙醇，继续浓缩至150mL，加等体积的乙酸乙酯萃取4次，剩下的水层减压除去残留的乙酸乙酯后，用等体积水饱和的正丁醇萃取5次，合并水饱和正丁醇萃取液，回收正丁醇，得水饱和正丁醇提取物3.8g。正丁醇提取物过硅胶柱，配置不同比例的二氯甲烷和甲醇混合液（20∶1；10∶1；5∶1；xa01∶1）各300ml，收集比例为1∶1的洗脱液，浓缩，真空干燥，得合欢皮抗肿瘤有效部位提取物。实施例4xa0抗肿瘤活性实验以实施例1得到的合欢皮抗肿瘤有效部位提取物为受试药物，体外培养U251，取指数生长期的细胞，用胰酶消化后，1500r﹒min^-1离心5min，将细胞重悬于培养基中，细胞浓度调至2×10⁴个/ml，接种于96孔细胞培养板中，每孔100μl，放置细胞培养箱（37℃，5%CO₂）中培养24h，之后加入受试药物20μl，阴性对照组加入终浓度为0.5%DMSO，各组均设3个复孔。在加药48h后，每孔加入5mg﹒mL^-1MTT试剂20μl，继续置于37℃培养4h。每孔加入DMSO100μl，振荡混匀，测定各孔在波长570nm处的吸光度值。计算细胞增殖抑制率：抑制率（%）=（1-实验组吸光度/对照组吸光度）×100%。表1xa0xa0合欢皮提取物抗肿瘤活性实验（U251）ntent="drawing" img-format="jpg" inline="no" orientation="portrait" wi="552"/>实施例5用实施例2和实施例3所得的合欢皮抗肿瘤有效部位提取物重复实施例4抗肿瘤活性试验，得到与实施例4相同的结果。